ISOLASI (EKSTAKSI) DNA

 

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan. DNA terdapat di nukleus, mitokondria, dan kloroplas. Satu sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan akan diturunkan pada keturunannya. DNA dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. Isolasi DNA merupakan langkah tepat untuk mempelajari DNA. Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis.

Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.

 

Alat dan Bahan :

   1.      Tabung microcentrifuge 1,5 ml steril

   2.      Zat anti coagulant (EDTA, heparin atau Citrate)

   3.      1 ml darah (whole blood)

   4.      Micropipette

   5.      900 πl “Cell Lysis Solution”.

   6.      sentrifuge 13.000 rpm

   7.      vortex

   8.      Pipet otomatis

   9.      300 πl “Nuclei Lysis Solution”

   10. 100 πl “Protein Precipitation Solution”

   11.  larutan RNA-ase 1,5 ml

   12.  300 πl isopropanol

   13.  ethanol  

   14.    kertas absorbent

   15.   100 πl “DNA Rehydration Solution”

Cara kerja Isolasi “genomic DNA” dari “whole blood”

   1.      Tabung microcentrifuge 1,5 ml steril (pertama) diisi dengan zat anti coagulant (EDTA, heparin atau Citrate) dan masukkan 1 ml darah (whole blood) ke dalamnya.

   2.      Tabung microcentrifuge tersebut digoyangkan perlahan agar darah dan zat anti coagulantnya bercampur dengan baik.

  3.      Dengan menggunakan micropipette, ke dalam tabung microcentrifuge steril yang lain (kedua) diisikan sebanyak 900 ml “Cell Lysis Solution”.

   4.      Pipetkan 300 µl darah dari tabung microcentrifuge pertama, masukkan ke dalam tabung kedua yang berisi “Cell Lysis Solution”. Tabung di bolak-balikkan 5-6 kali supaya larutannya bercampur.

   5.      Tabung tersebut diinkubasikan selama 10 menit pada temperature ruang dan tabung dibolak-balikkan 2-3 kali selama masa inkubasi agar lysis sel-sel darah merah berlangsung lebih baik.

   6.      Tabung microcentrifuge tersebut disentrifugasi pada 13.500 rpm (13.000 – 16.000 x g) selama 20 detik pada temperature ruang.

   7.      Supernatant dibuang sebanyak mungkin tanpa mengganggu pellet putih yang tampak. Lebih kurang 10-20 µl l cairan residu akan tertinggal dalam tabung tersebut.

   8.      Tabung di vortex dengan kuat, sebentar (10-15 detik) agar supaya endapan sel-sel darah putih tersuspensi kembali.

   9.      Sebanyak 300 µl “Nuclei Lysis Solution” ditambahkan ke dalam suspense di atas, larutan dibuat bercampur dengan cara dipipetkan berulang-ulang sampai 5-6 kali untuk melysis sel-sel darah putih. Solution akan menjadi “viscous”.

  10.  Jika terlihat gumpalan, maka inkubasikan tabung pada 37⁰C sampai gumpalan tersebut larut. Tabung didinginkan pada temperature ruangan. Setelah dingin barulah ditambahkan ke dalam “Nuclear Lysate” ini 100 µl “Protein Precipitation Solution”

   11.  Optional :tambahkan larutan RNA-ase 1,5 ml ke dalam “Nuclear Lysate” dan bolak-balikkan tabung 2-5 kali untuk mencampurnya. Inkubasikan pada 37⁰Cselama 15 menit dan kemudian dinginkan pada temperature ruangan.

  12.  Ditambah sebanyak 100 µl “Protein Precipitation Solution” ke dalam larutan “Nuclear Lysate” dan tabung divortex dengan kuat selama 10-20 detik. Gumpalan protein yang kecil mungkin akan terlihat.

   13.  Tabung disentrifugasi 13.500 rpm (13.000-16.000 x g) selama 3 menit, pada temperature ruangan. Pellet protein yang bewarna coklat tua akan terlihat.

   14.  Supernatan dipindahkan kedalam tabung microcentrifuge bersih dan steril yang telah diisi dengan 300 µl isopropanol (temperature ruang).

   15.  Tabung dibalikkan perlahan-lahan beberapa kali supaya larutan bercampur hingga terlihat DNA strands seperti benang-benang putih.

   16.  Setelah itu tabung disentrifugasi pada 13.500 rpm (13.000-16.000 x g) selama 1 menit pada temperature ruangan. DNA akan terlihat sebagai pellet kecil yang putih.

  17.  Supernatant dibuang dan tambahkan 300 µl 70% ethanol (temperature ruang) ke dalam DNA tersebut. Bolak-balikkan tabung perlahan beberapa kali untuk mencuci pellet DNA, tabung disentrifugasi lagi seperti pada langkah 15 di atas.

  18.  Dengan hati-hati aspirasikan ethanol (menggunakan micropipette), jangan sampai pelletnya terbuang. Kemudian tabung diletakkan secara terbalik di atas kertas absorbent dan keringkan di udara selama 10-15 menit.

  19.  Terakhir tambahkan 100 µl “DNA Rehydration Solution” ke dalam tabung tersebut dan rehidrasi DNA dengan mengginkubasi tabung pada 65⁰Cselama 1 jam. Secara periodic, campurkan larutan dengan cara menepuk tabung perlahan atau boleh juga dengan cara membiarkannya pada 4⁰C selama satu malam.

  20.  Larutan DNA dapat disimpan pada temperature 2⁰C - 8⁰C atau pada temperature -20⁰C untuk waktu yang cukup lama.